Objetivo:
Determinar la presencia de sangre en heces.
Fundamento teórico:
Hasta hace poco tiempo, las técnicas utilizadas para la determinación cualitativa se basaban en la actividad peroxidasa de la Hb, que actuaba catalizando la reacción entre H2O2 y un compuesto indicador el cual experimentaba un cambio de color.
2H2----HB--> 2H2O + O2
O2+indicador----> cambio de color
Actualmente exiten métodos basados en inmunoensayos cualitativos (inmunocromatografía) con Ac monoclonales frente a Hb humana.
Utilidad clínica:
La sangre oculta en heces es muy importante para el estudio de las neoplasias digestivas y de las anemias ferropénicas sin causa evidente.
Materiales y reactivos:
-Heces.
-Víal
-Inmunocromatografía
Procedimiento:
-Tomar una muestra.
-Agitar el vial y romper la punta.
-Añadir a la inmunocromatografía 4 gotas de la mezcla muestra-diluyente.
Resultados:
Método del reactivo de Fehling.
Objetivo:
Determinación de glucosa en orina:
Fundamento teórico:
La glucosa plásmtica se filtra a tavés del glomérulo y se reabsorbe en su totalidad en los tubulos proximales. La glucosa aparece en orina cuando se sobrepase su dintel renal.
La glucosa es el azúcar que se busca normalmente en orina, aunque también puede ser significativa la presencia de otros azucares como fructosa...etc.
Reacción que tiene lugar:
Utilidad clínica:
Pedemos encontrarnos con glucemia cuando el azúcar en orina se sitúa en torno a (160-180)mg/dl o cuando la reabsorción tubular falla (glucosuria renal).
Materiales y reactivos:
-Orina.
-Reactivo de Fehling A (tartrato alcalino en agua).
-Reactivo de Fehling B (CuSO4).
-Mechero.
-Pinzas de madera.
-Tubo de ensayo.
Procedimiento:
-En un tubo de ensayo añadimos 3ml de orina, 1ml de Fehling A y 1ml de Fehling B.
-Calentar el tubo en el mechero.
Conclusiones:
En nuestro tubo de ensayo se produjo un cambio de color de azul a rojo-naranja por lo que podemos concluir que en la orina analizada presenta glucosa.
Determinación de glucosa en orina:
Fundamento teórico:
La glucosa plásmtica se filtra a tavés del glomérulo y se reabsorbe en su totalidad en los tubulos proximales. La glucosa aparece en orina cuando se sobrepase su dintel renal.
La glucosa es el azúcar que se busca normalmente en orina, aunque también puede ser significativa la presencia de otros azucares como fructosa...etc.
Reacción que tiene lugar:
Utilidad clínica:
Pedemos encontrarnos con glucemia cuando el azúcar en orina se sitúa en torno a (160-180)mg/dl o cuando la reabsorción tubular falla (glucosuria renal).
Materiales y reactivos:
-Orina.
-Reactivo de Fehling A (tartrato alcalino en agua).
-Reactivo de Fehling B (CuSO4).
-Mechero.
-Pinzas de madera.
-Tubo de ensayo.
Procedimiento:
-En un tubo de ensayo añadimos 3ml de orina, 1ml de Fehling A y 1ml de Fehling B.
-Calentar el tubo en el mechero.
Conclusiones:
En nuestro tubo de ensayo se produjo un cambio de color de azul a rojo-naranja por lo que podemos concluir que en la orina analizada presenta glucosa.
Examen microscópico del sedimento urinario.
Objetivo:
Diagnóstico y evolución de las enfermedades renales.
Fundamento teórico:
En muchos laboratorios se considera el examen microscópico como una prueba de rutina, algunas autoridades, en la materia defiende que ante la orina clara con densidad mayor de 1.015 y negativa para proteína, leucocitos y sangre no es necesario el examen microcóspico.
El sedimento obtenido mediante centrifugación de la orina contiene todos aquellos materiales insolubles ( denominados elementos formes) que se han acumulado en orina mediante el proceso de formació, también podemos encontrar cristales de distintas formas y tamaños dependiendo del pH de la orina ( generalmente tienen poca importancia clínica)
Materiales y Reactivos:
-Orina.
-Centrifugadora.
-Tubo de centrifuga.
Procedimiento:
-Mezclar bien la muestra y depositar en un tubo de centrifuga cónico 10ml.
-Centrifugar a (1500-2000) rpm durante, al menos 5 minutos.
-Decantar la muestra. Volver a suspender el sedimento en unas gotas de orina.
-Colocar una gota de sedimento sobre un porta y taparla con un cubre, evitar la formación de burbujas.
-Observar con diafragma casi cerrado y condesador bajo.
-Examinar en primer lugar un área grande con poco aumento (mayor aumento 40X).
Observaciones :
Debemos medir el pH de la orina porque depende de las distintas foras y tamaños y nos puede dar pistas de lo que puede estar presente en esa orina.
Observamos:
Diagnóstico y evolución de las enfermedades renales.
Fundamento teórico:
En muchos laboratorios se considera el examen microscópico como una prueba de rutina, algunas autoridades, en la materia defiende que ante la orina clara con densidad mayor de 1.015 y negativa para proteína, leucocitos y sangre no es necesario el examen microcóspico.
El sedimento obtenido mediante centrifugación de la orina contiene todos aquellos materiales insolubles ( denominados elementos formes) que se han acumulado en orina mediante el proceso de formació, también podemos encontrar cristales de distintas formas y tamaños dependiendo del pH de la orina ( generalmente tienen poca importancia clínica)
Materiales y Reactivos:
-Orina.
-Centrifugadora.
-Tubo de centrifuga.
Procedimiento:
-Mezclar bien la muestra y depositar en un tubo de centrifuga cónico 10ml.
-Centrifugar a (1500-2000) rpm durante, al menos 5 minutos.
-Decantar la muestra. Volver a suspender el sedimento en unas gotas de orina.
-Colocar una gota de sedimento sobre un porta y taparla con un cubre, evitar la formación de burbujas.
-Observar con diafragma casi cerrado y condesador bajo.
-Examinar en primer lugar un área grande con poco aumento (mayor aumento 40X).
Observaciones :
Debemos medir el pH de la orina porque depende de las distintas foras y tamaños y nos puede dar pistas de lo que puede estar presente en esa orina.
Observamos:
LDH
Objetivo:
Determinar cuantitativa de lactato deshidrogenasa.
Fundamento teórico:
El lactato deshidrogenasa cataliza la reducción del piruvato por el NADH.
LDH
Piruvato + NADH+H+-------->lactato +NAD+
Esta determinación se realiza mediante cinética. se realiza varias medidas separadas por un tiempo. Es descendente.
La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio determinado es proporcional a la concentración catalítica de LDH.
Significado clínico:
El lactato deshidrogenasa es una enzima distribuida por todo el organismo humano, aunque las mayores concentraciones se encuentran en el corazón, hígado, riñón, músculo esquelético y eritrocitos.
El nivel de LDH en suero está elevado en pacientes con enfermedades de hígado, infartos de miocardio, alteraciones renales, disfrotas musculares y anemias.
Materiales y Reactivos:
-Cubetas.
-Espectrofotómetro.
-Baño termoestable.
-R1 Tampón.
-R2 Substrato.
-Suero
Procedimiento:
-Encender el espectrofotómetro.
-Indicar las siguientes condiciones de trabajo:
Longitud de onda --------340nm
Cubeta -------1cm paso de luz
Temperatura constante -- 25ºC/30ºC/37ºC
-Ajustar el espectrofotómetro a cero frente con agua destilada
-En un tubo de ensayo añadir 50 microlitros de muestra y 3ml de reactivo de trabajo, mezclar y añadir a una cubeta.
-Incubar durante 1 minuto.
-Leer la absorbancia inicial de la muestra poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia cada 3 minutos
-Calcular el promedio de incremento de absorbancia por minuto.
Resultados:
1-1.873
2-1.859
3-1.846
4-1.833
Concentración= 130
1.873-1.859=0.014
1.859-1.846=0.013
1.846-1.833=0.013
(0.014+0.013+0.013)/3=0.013
0.013*9690=195.97 U/L LDH.
Observaciones:
En las prácticas cinemáticas no hay patrón porque nos da el fabricante el factor, el blanco de reactivo tampoco es necesario porque medimos los saltos.
Conclusiones:
En esta práctica hemos obtenido un valor de 195.97 U/L LDH, valor fuera del intervalo de referencia (230-450)U/L
Determinar cuantitativa de lactato deshidrogenasa.
Fundamento teórico:
El lactato deshidrogenasa cataliza la reducción del piruvato por el NADH.
LDH
Piruvato + NADH+H+-------->lactato +NAD+
Esta determinación se realiza mediante cinética. se realiza varias medidas separadas por un tiempo. Es descendente.
La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio determinado es proporcional a la concentración catalítica de LDH.
Significado clínico:
El lactato deshidrogenasa es una enzima distribuida por todo el organismo humano, aunque las mayores concentraciones se encuentran en el corazón, hígado, riñón, músculo esquelético y eritrocitos.
El nivel de LDH en suero está elevado en pacientes con enfermedades de hígado, infartos de miocardio, alteraciones renales, disfrotas musculares y anemias.
Materiales y Reactivos:
-Cubetas.
-Espectrofotómetro.
-Baño termoestable.
-R1 Tampón.
-R2 Substrato.
-Suero
Procedimiento:
-Encender el espectrofotómetro.
-Indicar las siguientes condiciones de trabajo:
Longitud de onda --------340nm
Cubeta -------1cm paso de luz
Temperatura constante -- 25ºC/30ºC/37ºC
-Ajustar el espectrofotómetro a cero frente con agua destilada
-En un tubo de ensayo añadir 50 microlitros de muestra y 3ml de reactivo de trabajo, mezclar y añadir a una cubeta.
-Incubar durante 1 minuto.
-Leer la absorbancia inicial de la muestra poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia cada 3 minutos
-Calcular el promedio de incremento de absorbancia por minuto.
Resultados:
1-1.873
2-1.859
3-1.846
4-1.833
Concentración= 130
1.873-1.859=0.014
1.859-1.846=0.013
1.846-1.833=0.013
(0.014+0.013+0.013)/3=0.013
0.013*9690=195.97 U/L LDH.
Observaciones:
En las prácticas cinemáticas no hay patrón porque nos da el fabricante el factor, el blanco de reactivo tampoco es necesario porque medimos los saltos.
Conclusiones:
En esta práctica hemos obtenido un valor de 195.97 U/L LDH, valor fuera del intervalo de referencia (230-450)U/L
Proteinograma.
Objetivo:
El proteinograma es utilizado para analizar las proteínas de manera semicuantitativa presentes en el suero.
Fundamento teórico:
Las proteínas constituyen un tipo de biomoléculas formadas por aminoácidos unidos por enlace peptidico. son moléculas anfóteras, en medios básicos adquieren una carga global negativa.
Las proteínas en medio básico adquiere una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sométidas a un proceso electroforético.
Las migraciones que se obtienen son las siguientes:
-Albúmina.
-Alfa 1-globulina
-Alfa 2-globulina
-Beta-globulina
-Gamma-globulina
Para la lectura del proteinograma tenemos tres posibilidades:
Elución:
En cuatro tubos de ensayo añadimos ac. acético 80% , cortar cada banda. El disolvente se come el acetato de celulosa y en los tubos se produce un color el cual medimos en el espectrofotómetro su absorbancia .
La suma de todas las absorbancias será la absorbancia total .
Si queremos saber el número de proteínas cogo el refractometro ( para medir proteínas totales).
Fotodensitómetro:
Este método consiste en el oscilamiento de la luz sobre la placa. La placa se va desplazando lentamente. Cada vez que se detecta una mancha se produce un salto.
Scaner + Softaware:
Softaware nos proporciona un gráfico y los valores de albúmina, alfa, beta y gamma.
Normalmente en %.
Materiales y reactivos:
-Solución tampón (Tris hipurato)
-Rojo Ponceau.
-Decolorante rojo Ponceau (ácido acético al 5%).
-Solución transparentadora.
-Láminas Mylar.
-Papel de filtro.
-Tiras de acetato de celulosa.
-Cubeta
-Suero
-Aplicador de suero
Procedimiento:
-Preparamos el tampón (100ml de tris hipurato en 1000ml de agua destilada) y el decolorante ( 50 ml de ác.acético puro en 1000ml de agua destilada).
-Introducir las tiras en solución tampón y realizar movimientos rotatorios.
-Llenar completamente el compartimento de la cámara de electroforesis de tampón.
-Las tiras impregnadas de tampón, las colocamos entres dos hojas de papel de filtro y colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba .
-Depositamos la muestra (suero) con un aplicador, la aplicación debe hacerse a unos 2 cm del borde situado cerca del polo negativo.
- Tapamos la camara, conectamos la fuente de alimentación a 200v durante 35 minutos. Una vez terminado el proceso desconectamos la fuente de alimentación.
-Sumergir las tiras en colorante Rojo Ponceau durante 5 minutos, realizar movimientos rotatorios.
-Sumergir las tiras en solución de ácido acético 5% (en dos o tres bandejas para obtener un fondo blanco).
- Y por último sumergir en líquido transparentador durante 1 minuto, realizar movimiento rotatorio, colocar las tiras sobre la superficie de Mylar film (eliminando los bordes sobrantes) y eliminar el exceso de liquido transparentador con un rodillo.
-Calentar la tira a 80ºC en una estufa durante 10 minutos.
-Cuantificación mediante fotodensitómetro:
-Con unas tijeras cortamos las bandas.
-Extraemos el portaplacas y quitamos el cristal superior, colocamos la placa dejando la albúmina sobre la serie blanca.
-Para que dibuje la gráfica colocamos un papel, coincidiendo con la area blanca, colocamos un lápiz y bajamos.
-El cero se realiza mediante el apagado de los dos puntos.
-El aparato dispone de tres botones:
Amarillo-bajar lápiz.
Verde- para interpletar
Rojo-mueve la parte gráfica.
-Primero dibujamos , la tecla verde muever el lápiz hacia el sentido contrario y se vuelve a pulsar el rojo.
Observaciones:
-No utilizemos el método de cuantificación de elución porque está en desuso.
-El fotodensitómetro tiene un selector de onda por lo que debemos indicarle el color del colorante (rojo, negro o blanco).
Resultados:
1 pico 87
2 pico 11
3 pico 13
4 pico 18 + 37
Proteínas totales= 317
317-27= 290
290-----100%
87 -----X
X=30% Albúmina
Realizando el mismo calculo en los anteriores nos da:
Alfa globulina---3.8%
Beta-globulina---4.48%
Gammaglobulina---18.96%
En un último pico hay 27, este valor debe ser restado al total de proteínas totales (debido a un fallo del aparato).
Interpretación de resultados :
Valores normales:
Albúmina----(57-65)%
Alfa-1 globulina---(1-4)%
Alfa-2 globilina----(6-10)%
Betaglobulina---(8-12)%
Gammaglobulinas---(12-19)%
Comparando los valores podemos destacar que casi todos entran los rangos de normalidad excepto la Betaglobulina que es muy inferior comparada con el rango.
El proteinograma es utilizado para analizar las proteínas de manera semicuantitativa presentes en el suero.
Fundamento teórico:
Las proteínas constituyen un tipo de biomoléculas formadas por aminoácidos unidos por enlace peptidico. son moléculas anfóteras, en medios básicos adquieren una carga global negativa.
Las proteínas en medio básico adquiere una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sométidas a un proceso electroforético.
Las migraciones que se obtienen son las siguientes:
-Albúmina.
-Alfa 1-globulina
-Alfa 2-globulina
-Beta-globulina
-Gamma-globulina
Para la lectura del proteinograma tenemos tres posibilidades:
Elución:
En cuatro tubos de ensayo añadimos ac. acético 80% , cortar cada banda. El disolvente se come el acetato de celulosa y en los tubos se produce un color el cual medimos en el espectrofotómetro su absorbancia .
La suma de todas las absorbancias será la absorbancia total .
Si queremos saber el número de proteínas cogo el refractometro ( para medir proteínas totales).
Fotodensitómetro:
Este método consiste en el oscilamiento de la luz sobre la placa. La placa se va desplazando lentamente. Cada vez que se detecta una mancha se produce un salto.
Scaner + Softaware:
Softaware nos proporciona un gráfico y los valores de albúmina, alfa, beta y gamma.
Normalmente en %.
Materiales y reactivos:
-Solución tampón (Tris hipurato)
-Rojo Ponceau.
-Decolorante rojo Ponceau (ácido acético al 5%).
-Solución transparentadora.
-Láminas Mylar.
-Papel de filtro.
-Tiras de acetato de celulosa.
-Cubeta
-Suero
-Aplicador de suero
Procedimiento:
-Preparamos el tampón (100ml de tris hipurato en 1000ml de agua destilada) y el decolorante ( 50 ml de ác.acético puro en 1000ml de agua destilada).
-Introducir las tiras en solución tampón y realizar movimientos rotatorios.
-Llenar completamente el compartimento de la cámara de electroforesis de tampón.
-Las tiras impregnadas de tampón, las colocamos entres dos hojas de papel de filtro y colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba .
-Depositamos la muestra (suero) con un aplicador, la aplicación debe hacerse a unos 2 cm del borde situado cerca del polo negativo.
- Tapamos la camara, conectamos la fuente de alimentación a 200v durante 35 minutos. Una vez terminado el proceso desconectamos la fuente de alimentación.
-Sumergir las tiras en colorante Rojo Ponceau durante 5 minutos, realizar movimientos rotatorios.
-Sumergir las tiras en solución de ácido acético 5% (en dos o tres bandejas para obtener un fondo blanco).
- Y por último sumergir en líquido transparentador durante 1 minuto, realizar movimiento rotatorio, colocar las tiras sobre la superficie de Mylar film (eliminando los bordes sobrantes) y eliminar el exceso de liquido transparentador con un rodillo.
-Calentar la tira a 80ºC en una estufa durante 10 minutos.
-Cuantificación mediante fotodensitómetro:
-Con unas tijeras cortamos las bandas.
-Extraemos el portaplacas y quitamos el cristal superior, colocamos la placa dejando la albúmina sobre la serie blanca.
-Para que dibuje la gráfica colocamos un papel, coincidiendo con la area blanca, colocamos un lápiz y bajamos.
-El cero se realiza mediante el apagado de los dos puntos.
-El aparato dispone de tres botones:
Amarillo-bajar lápiz.
Verde- para interpletar
Rojo-mueve la parte gráfica.
-Primero dibujamos , la tecla verde muever el lápiz hacia el sentido contrario y se vuelve a pulsar el rojo.
Observaciones:
-No utilizemos el método de cuantificación de elución porque está en desuso.
-El fotodensitómetro tiene un selector de onda por lo que debemos indicarle el color del colorante (rojo, negro o blanco).
Resultados:
1 pico 87
2 pico 11
3 pico 13
4 pico 18 + 37
Proteínas totales= 317
317-27= 290
290-----100%
87 -----X
X=30% Albúmina
Realizando el mismo calculo en los anteriores nos da:
Alfa globulina---3.8%
Beta-globulina---4.48%
Gammaglobulina---18.96%
En un último pico hay 27, este valor debe ser restado al total de proteínas totales (debido a un fallo del aparato).
Interpretación de resultados :
Valores normales:
Albúmina----(57-65)%
Alfa-1 globulina---(1-4)%
Alfa-2 globilina----(6-10)%
Betaglobulina---(8-12)%
Gammaglobulinas---(12-19)%
Comparando los valores podemos destacar que casi todos entran los rangos de normalidad excepto la Betaglobulina que es muy inferior comparada con el rango.
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