Proteinograma.

Objetivo:

El proteinograma es utilizado  para analizar las proteínas de manera semicuantitativa presentes en el suero.

Fundamento teórico:

Las proteínas constituyen un tipo de biomoléculas  formadas por aminoácidos unidos por enlace peptidico. son moléculas anfóteras, en medios básicos adquieren una carga global negativa.

Las proteínas en medio básico adquiere una carga global  negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sométidas a un proceso electroforético.

Las migraciones que se obtienen son las siguientes:

-Albúmina.

-Alfa 1-globulina

-Alfa 2-globulina

-Beta-globulina

-Gamma-globulina


Para la lectura del proteinograma tenemos tres posibilidades:


Elución:


En cuatro tubos de ensayo  añadimos ac. acético 80%  , cortar cada banda. El disolvente se come el acetato de celulosa y en los tubos se produce un color el cual medimos en el espectrofotómetro su absorbancia .

La suma de todas las absorbancias será la absorbancia total .

Si queremos saber el número de proteínas cogo el refractometro ( para medir proteínas totales).



Fotodensitómetro:

Este método consiste en el oscilamiento de  la luz sobre la placa. La placa se va desplazando lentamente. Cada vez que se detecta una mancha se produce un salto.


Scaner + Softaware:

Softaware nos proporciona un gráfico y los valores de albúmina, alfa, beta y gamma.

Normalmente en   %.



Materiales y reactivos:

-Solución tampón (Tris hipurato)

-Rojo Ponceau.

-Decolorante rojo Ponceau (ácido acético al 5%).

-Solución transparentadora.

-Láminas Mylar.

-Papel de filtro.

-Tiras de acetato de celulosa.

-Cubeta

-Suero

-Aplicador de suero


Procedimiento:

-Preparamos el tampón (100ml de tris hipurato en 1000ml de agua destilada) y el decolorante ( 50 ml de ác.acético puro en 1000ml de agua destilada).

-Introducir las tiras en solución  tampón y realizar movimientos rotatorios.

-Llenar completamente el compartimento de la cámara de electroforesis  de tampón.

-Las tiras impregnadas de tampón, las colocamos entres dos hojas de papel de filtro y colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba .

 -Depositamos la muestra (suero) con un aplicador, la aplicación debe hacerse a unos 2 cm del borde situado cerca del polo negativo.

- Tapamos la camara, conectamos la fuente de alimentación a 200v durante 35 minutos. Una vez terminado el proceso desconectamos la fuente de alimentación.

-Sumergir las tiras en colorante Rojo Ponceau durante 5 minutos, realizar movimientos rotatorios.

-Sumergir las tiras en solución de ácido acético 5% (en dos o tres bandejas para obtener un fondo blanco).

-  Y por último sumergir en líquido transparentador durante 1 minuto, realizar movimiento rotatorio, colocar las tiras sobre la superficie de Mylar film (eliminando los bordes sobrantes) y eliminar el exceso de liquido transparentador con un rodillo.

-Calentar la tira a 80ºC en una estufa durante 10 minutos.


-Cuantificación mediante fotodensitómetro:

-Con unas tijeras cortamos las bandas.

-Extraemos el portaplacas y quitamos el cristal superior, colocamos la placa dejando la albúmina sobre la serie blanca.

-Para que dibuje la gráfica colocamos un papel, coincidiendo con la area blanca, colocamos un lápiz y bajamos.

-El cero se realiza mediante el apagado de los dos puntos.

-El aparato dispone de tres botones:

     Amarillo-bajar lápiz.

     Verde- para interpletar

      Rojo-mueve la parte gráfica.


-Primero dibujamos , la tecla verde  muever el  lápiz hacia el sentido contrario y se vuelve a pulsar     el   rojo.


Observaciones:

-No utilizemos el método de cuantificación de elución porque está en desuso.

-El fotodensitómetro tiene un selector de onda por lo que debemos indicarle el color del colorante (rojo, negro o blanco).




Resultados:

1 pico   87
2 pico   11
3 pico   13
4 pico   18 + 37

Proteínas totales= 317

317-27= 290

290-----100%
87 -----X

X=30% Albúmina

Realizando el mismo calculo en los anteriores nos da:

Alfa globulina---3.8%

Beta-globulina---4.48%

Gammaglobulina---18.96%


En un último pico hay 27, este valor debe ser restado al total de proteínas totales (debido a un fallo del aparato).

Interpretación de resultados :


Valores normales:

Albúmina----(57-65)%

Alfa-1 globulina---(1-4)%

Alfa-2 globilina----(6-10)%

Betaglobulina---(8-12)%

Gammaglobulinas---(12-19)%



Comparando los valores podemos destacar que casi todos entran los rangos de normalidad excepto la Betaglobulina  que es muy inferior comparada con el rango.