Sangre oculta en heces

Objetivo:

Determinar la presencia de sangre en heces.

Fundamento teórico:

Hasta hace poco tiempo, las técnicas utilizadas para la determinación cualitativa se basaban en la actividad peroxidasa de la Hb, que actuaba catalizando la reacción entre H2O2 y un compuesto indicador el cual experimentaba un cambio de color.

2H2----HB--> 2H2O + O2

O2+indicador----> cambio de color

Actualmente exiten métodos basados en inmunoensayos cualitativos (inmunocromatografía) con Ac monoclonales frente a Hb humana.

 



Utilidad clínica:

La sangre oculta en heces es muy importante para el estudio de las neoplasias digestivas y de las anemias ferropénicas sin causa evidente.



Materiales y reactivos:

-Heces.

-Víal

-Inmunocromatografía


Procedimiento:

-Tomar una muestra.

-Agitar el vial y romper la punta.

-Añadir a la inmunocromatografía 4 gotas de la mezcla muestra-diluyente.



Resultados:


Método del reactivo de Fehling.

Objetivo:

Determinación de glucosa en orina:

 Fundamento teórico:

La glucosa plásmtica se filtra a tavés del glomérulo y se reabsorbe en su totalidad en los tubulos proximales. La  glucosa aparece en orina cuando se sobrepase su dintel renal.

La glucosa es el azúcar que se busca normalmente en orina, aunque también puede ser significativa la presencia de otros azucares como fructosa...etc.

Reacción que tiene lugar:

 


Utilidad clínica:

Pedemos encontrarnos con glucemia cuando el azúcar en orina se sitúa en torno a (160-180)mg/dl o cuando la reabsorción tubular falla (glucosuria renal).


Materiales y reactivos:

-Orina.

-Reactivo de Fehling A (tartrato alcalino en agua).

-Reactivo de Fehling B (CuSO4).

-Mechero.

-Pinzas de madera.

-Tubo de ensayo.


Procedimiento:

-En un tubo de ensayo añadimos 3ml de orina, 1ml de Fehling A y 1ml de Fehling  B.

-Calentar el tubo en el mechero.




 Conclusiones:

En nuestro tubo de ensayo se produjo un cambio de color de azul a rojo-naranja por lo que podemos concluir que en la orina analizada presenta glucosa. 


Examen microscópico del sedimento urinario.

Objetivo:

Diagnóstico y evolución de las enfermedades renales.

Fundamento teórico:

En muchos laboratorios se considera el examen microscópico como una prueba de rutina, algunas autoridades, en la materia defiende que ante la orina clara con densidad mayor de 1.015 y negativa para proteína, leucocitos y sangre no es necesario el examen microcóspico.


El sedimento obtenido mediante centrifugación de la orina contiene todos aquellos materiales insolubles ( denominados elementos formes) que se han acumulado en orina mediante el proceso de formació, también podemos encontrar cristales de distintas formas y tamaños dependiendo del pH de la orina  ( generalmente tienen poca importancia clínica)

Materiales y Reactivos:

-Orina.

-Centrifugadora.

-Tubo de centrifuga.


Procedimiento:

-Mezclar  bien la muestra y depositar en un tubo de centrifuga cónico 10ml.

-Centrifugar a (1500-2000) rpm durante, al menos 5 minutos.

-Decantar la muestra. Volver a suspender el sedimento en unas gotas de orina.

-Colocar una gota de sedimento sobre un porta y taparla con un cubre, evitar la formación de burbujas.

-Observar con diafragma casi cerrado y condesador bajo.

-Examinar en primer lugar un área grande con poco aumento (mayor aumento 40X).

Observaciones :

Debemos medir el pH de la orina porque depende de las distintas foras y tamaños y nos puede dar pistas de lo que puede estar presente en esa orina.



Observamos:



















LDH

Objetivo:

Determinar cuantitativa de lactato deshidrogenasa.

Fundamento teórico:

El lactato deshidrogenasa cataliza la reducción del piruvato por el NADH.
                                        LDH
Piruvato + NADH+H+-------->lactato +NAD+

Esta determinación se realiza mediante cinética. se realiza varias medidas separadas por un tiempo. Es descendente.

La velocidad de disminución de la concentración  de NADH en el medio determinado es proporcional a la concentración catalítica de LDH.

Significado clínico:

El lactato deshidrogenasa es una enzima distribuida por todo el organismo humano, aunque las mayores concentraciones se encuentran en el corazón, hígado, riñón, músculo esquelético y eritrocitos.

El nivel de LDH en suero está elevado en pacientes con enfermedades  de hígado, infartos de miocardio, alteraciones renales, disfrotas musculares y anemias.


Materiales y Reactivos:

-Cubetas.

-Espectrofotómetro.

-Baño termoestable.

-R1 Tampón.

-R2 Substrato.

-Suero


Procedimiento:

-Encender el espectrofotómetro.

-Indicar las siguientes condiciones de trabajo:

  Longitud  de onda  --------340nm
  Cubeta                    -------1cm paso de luz
  Temperatura constante -- 25ºC/30ºC/37ºC
-Ajustar el espectrofotómetro a cero frente con agua destilada

-En un tubo de ensayo añadir 50 microlitros de muestra y 3ml de reactivo de trabajo, mezclar y añadir a una cubeta.

-Incubar durante 1 minuto.

-Leer la absorbancia inicial de la muestra poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia cada 3 minutos

-Calcular el promedio de incremento de absorbancia por minuto.


 Resultados:

1-1.873
2-1.859
3-1.846
4-1.833

Concentración= 130

1.873-1.859=0.014

1.859-1.846=0.013

1.846-1.833=0.013

(0.014+0.013+0.013)/3=0.013

0.013*9690=195.97 U/L LDH.

Observaciones:

En las prácticas cinemáticas no hay patrón porque nos da el fabricante el factor, el blanco de reactivo tampoco es necesario porque medimos los saltos.


Conclusiones:

En esta práctica hemos obtenido un valor de 195.97 U/L LDH, valor fuera del intervalo de referencia (230-450)U/L









Proteinograma.

Objetivo:

El proteinograma es utilizado  para analizar las proteínas de manera semicuantitativa presentes en el suero.

Fundamento teórico:

Las proteínas constituyen un tipo de biomoléculas  formadas por aminoácidos unidos por enlace peptidico. son moléculas anfóteras, en medios básicos adquieren una carga global negativa.

Las proteínas en medio básico adquiere una carga global  negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sométidas a un proceso electroforético.

Las migraciones que se obtienen son las siguientes:

-Albúmina.

-Alfa 1-globulina

-Alfa 2-globulina

-Beta-globulina

-Gamma-globulina


Para la lectura del proteinograma tenemos tres posibilidades:


Elución:


En cuatro tubos de ensayo  añadimos ac. acético 80%  , cortar cada banda. El disolvente se come el acetato de celulosa y en los tubos se produce un color el cual medimos en el espectrofotómetro su absorbancia .

La suma de todas las absorbancias será la absorbancia total .

Si queremos saber el número de proteínas cogo el refractometro ( para medir proteínas totales).



Fotodensitómetro:

Este método consiste en el oscilamiento de  la luz sobre la placa. La placa se va desplazando lentamente. Cada vez que se detecta una mancha se produce un salto.


Scaner + Softaware:

Softaware nos proporciona un gráfico y los valores de albúmina, alfa, beta y gamma.

Normalmente en   %.



Materiales y reactivos:

-Solución tampón (Tris hipurato)

-Rojo Ponceau.

-Decolorante rojo Ponceau (ácido acético al 5%).

-Solución transparentadora.

-Láminas Mylar.

-Papel de filtro.

-Tiras de acetato de celulosa.

-Cubeta

-Suero

-Aplicador de suero


Procedimiento:

-Preparamos el tampón (100ml de tris hipurato en 1000ml de agua destilada) y el decolorante ( 50 ml de ác.acético puro en 1000ml de agua destilada).

-Introducir las tiras en solución  tampón y realizar movimientos rotatorios.

-Llenar completamente el compartimento de la cámara de electroforesis  de tampón.

-Las tiras impregnadas de tampón, las colocamos entres dos hojas de papel de filtro y colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba .

 -Depositamos la muestra (suero) con un aplicador, la aplicación debe hacerse a unos 2 cm del borde situado cerca del polo negativo.

- Tapamos la camara, conectamos la fuente de alimentación a 200v durante 35 minutos. Una vez terminado el proceso desconectamos la fuente de alimentación.

-Sumergir las tiras en colorante Rojo Ponceau durante 5 minutos, realizar movimientos rotatorios.

-Sumergir las tiras en solución de ácido acético 5% (en dos o tres bandejas para obtener un fondo blanco).

-  Y por último sumergir en líquido transparentador durante 1 minuto, realizar movimiento rotatorio, colocar las tiras sobre la superficie de Mylar film (eliminando los bordes sobrantes) y eliminar el exceso de liquido transparentador con un rodillo.

-Calentar la tira a 80ºC en una estufa durante 10 minutos.


-Cuantificación mediante fotodensitómetro:

-Con unas tijeras cortamos las bandas.

-Extraemos el portaplacas y quitamos el cristal superior, colocamos la placa dejando la albúmina sobre la serie blanca.

-Para que dibuje la gráfica colocamos un papel, coincidiendo con la area blanca, colocamos un lápiz y bajamos.



-El cero se realiza mediante el apagado de los dos puntos.

-El aparato dispone de tres botones:

     Amarillo-bajar lápiz.

     Verde- para interpletar

      Rojo-mueve la parte gráfica.


-Primero dibujamos , la tecla verde  muever el  lápiz hacia el sentido contrario y se vuelve a pulsar     el   rojo.


Observaciones:

-No utilizemos el método de cuantificación de elución porque está en desuso.

-El fotodensitómetro tiene un selector de onda por lo que debemos indicarle el color del colorante (rojo, negro o blanco).




Resultados:

1 pico   87
2 pico   11
3 pico   13
4 pico   18 + 37

Proteínas totales= 317

317-27= 290

290-----100%
87 -----X

X=30% Albúmina

Realizando el mismo calculo en los anteriores nos da:

Alfa globulina---3.8%

Beta-globulina---4.48%

Gammaglobulina---18.96%


En un último pico hay 27, este valor debe ser restado al total de proteínas totales (debido a un fallo del aparato).






Interpretación de resultados :


Valores normales:

Albúmina----(57-65)%

Alfa-1 globulina---(1-4)%

Alfa-2 globilina----(6-10)%

Betaglobulina---(8-12)%

Gammaglobulinas---(12-19)%



Comparando los valores podemos destacar que casi todos entran los rangos de normalidad excepto la Betaglobulina  que es muy inferior comparada con el rango.


Urea

Objetivo:

Determinación cuantitativa de urea.

Fundamento teórico:

La cantidad de urea presente en la sangre permite detectar si los riñones tienen problemas para reabsorber la urea, que es un producto de desecho del hígado y del resto del cuerpo.

La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en amoniaco y anhidrido carbónico.
Los iones amonio reaccionan con salicilato e hipoclorito, en presencia del catalizador nitroprusiato, para formar un indofenol verde. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de urea en la muestra ensayada.

Valores de referencia: (15-45)mg/dl.

Materiales y Reactivos:

-Cubeta

-Espectrofotómetro

-Tubos de ensayo

-Gradilla

-Reactivo 1 (Tampón fosfato pH 6.7, EDTA, Salicilato sódico y Nitroprusiato sódico)

-Reactivo 2 (Hipoclorito sódico e hidróxido sódico)

-Reactivo 3 (Ureasa)

-Muestra (suero)

Procedimiento:

-Preparación del reactivo de trabajo: disolver R3 en el vial de R1.

-El R3 con ClONa está listo.

-Cogemos tres tubos de ensayo, uno para el blanco añadimos 1ml de reactivo de trabajo y otro ml de reactivo 2. Otro tubo para el patrón que está compuesto de 1ml de reactivo de trabajo, 1ml de reactivo de trabajo y 10 μL de patrón y por último el tubo de la muestra debe contener 1ml de reactivo de trabajo, 1ml de reactivo 2 y 10μL de muestra.

-Pasar el contenido de los tubos a tres cubetas.

-Medir la absorbancia en un espectrofotómetroa una longitud de onda de 580nm.

Resultados:

Blanco 0.0
Patrón 0.29
Muestra 0.314

(0.314/0.29)*50= 54.13mg/dl

Conclusiones:

El valor está fuera de los valores de normalidad.

Creatinina.

Objetivo:

Determinación cuantitativa de creatinina.

Fundamento teórico:

Se estudia la creatinina para ver si el riñon funciona correctamente. Se puede medir por medio de la sangre o de la orina.

El ensayo de la creatinina esta basado en la reacción de la creatinina con el picrato de sodio descrito por Jaffé. La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo rojizo. El intervalo de tiempo escogido para las lecturas permite eliminar gran parte de las interferencias conocidas del método. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de creatinina de la muestra.

Valores de referencia



Hombres
(0.7-1.4)mg/dl
Mujeres
(0.6-1.1)mg/dl


Materiales y Reactivos:

 

-Cubeta.

-Espectrofotómetro.

-Reactivo 1 (ácidopicrico)

-Muestra (suero).

-Reactivo 2 (Hidróxido sódico).

-Patrón.
 

-Tubo de ensayo

-Gradilla


Procedimiento:

-Preparación del  reactivo de trabajo: mezclar volumenes iguales de reactivo 1 y reactivo 2.

-Coger tres tubos de ensayo, en uno de ellos preparamos el blanco en el cual añadimos 1ml de reactivo de trabajo. En otro tubo, añadimos preparamos el patrón añadiendo 1ml de reactivo de trabajo y 100μL de patrón, en el último tubo añadimos 1ml de reactivo de trabajo y  100μL.
 

-El contenido de los tubos lo ponemos en las cubetas.

-Mezclar y poner en marcha el cronómetro.

-Leer la absorbancia al cabo de treinta segundos y al cabo de noventa segundos de la adición de la muestra.


Resultados:



Creatinina
30``
60``
Blanco
0.001
0.00
Patrón
0.304
0.327
Muestra
0.314
0.349



Δpatrón=0.327-0.304=0.023

 Δmuestra=0.349-0.345=4*10-3

(4*10-3)/(0.023)*2=0.3478 mg/dl



Conclusiones:

El valor que no ha dado esta práctica no se encuentra dentro de los valores de normalidad. Los reactivos estaban caducados y a mis compañeros le salian datos similares.