Identificación y cuantificación de lipoproteínas en suero sanguíneo.

Objetivo:

Identificación y cuantificación de lipoproteínas en suero sanguineo.

Fundamento teórico:

Las lipoproteínas son macromoléculas compuestas por lípidos y proteínas encargadas del transporte.
Su función es envolver los líquidos insolubles en el plasma proveniente de alimentos y los sintetizados por nuestro organismo.

Se clasifican según la migración electroforética, durante el curso de la cual se separan en varias fracciones distintas que de menor a mayor se clasifican en quilimicrones, ß-lipoproteínas (LDL), pre-ß-lipoproteinas (VLDL), α -lipoproteínas (HDL) y pre-α -lipoproteínas.

Quilimicrones,	(4-13)%
ß-lipoproteínas (LDL)	(10-26)%
pre-ß-lipoproteinas (VLDL)	(0-15)%
α -lipoproteínas (HDL)	(55-75)%
Pre-α -lipoproteinas	(0)%

 

Materiales y Reactivos:

-Alimentador para electroforesis

-Cubeta

-Aplicador para la muestra.

-Tiras de Cellogel

-Papel de filtro

-Láminas de Mylar

-Pipeta automática

-Pinzas de disección

-Bandejas

-Placas de vidrio

-Estufa

-Tampón

-Colorante negro Súdan A

-Colorante negro Súdan B (NaOH al 5%)

-Solución transparentadora


Procedimiento:

-Preparación del tampón:

Añadimos 100ml de Tris-Hipuratoconcentrado en 1000mml de agua destilada.

-Preparación de las tiras de Cellogel:

Introducir las tiras en el tampón, agitar durante (10-15) minutos. Conservar las sobrantes en solución metanol al (30-40)%.

-Preparación de la cubeta de electroforesis:

Llenar una cubeta con tampón.

-Muestra:

Utilizar suero fresco y no hemolizado

-Preparación de la bandeja de muestras:

Pipetee 30μL  de cada muestra en al bandeja de muestras.

-Secado de las tiras:

Eliminar el exceso de tampón de las tiras entre dos hojas de papel de filtro.

-Colocación de las tiras en el puente y aplicación del suero:

Las tiras Cellogel se colocan en el puente con la superficie porosa hacia arriba. Coloca el puente en la camara de electroforesis. Con el aplicador (previamente cargado) aplicamos la muestra en la tira durante 10 segundos , cerca del polo negativo y a 1.5cm del borde. Tapamos la cubeta de electroforesis y conectamos la fuente de alimentación.



-Migración:

200V durante 35 minutos.
 

-Tinción:

Mezclar 50ml de Negro Sudán A con 50ml de negro de Sudán B. Sumergir la tira en la disolución de tinción durante dos horas.

-Decoloración:

Extraer la tira del baño y lavar con agua corriente.

-Transparentado:

Sumergir la tiras de Cellogel en la disolución transportadora  durante un minuto. Ponga la tira en una lámina Mylar y seque el exceso de líquido con papel de filtro. Calentar en al estufa a 80ºC durante (4-6) minutoshasta que la tira se vuelva semitransparente. Introducir en agua, la tira transparentará por completo. Cubra con otra lámina Mylar y leer el resultado en el fotodensitómetro a 580nm.













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Determinación del HDL-colesterol por espectrofotometría.

Objetivo:

Determinación del HDL.

Fundamento teórico:

El colesterol pertenece al grupo de lípidos que es útil para las fibras nerviosas, paredes celulares y equilibrio de ciertas hormonas.

El colesterol HDL (colesterol bueno) son lipoproteínas de alta densidad que realizan  la función de eliminar el exceso del colesterol (colesterol malo).

Los niveles de colesterol deben ser HDL-alto y LDL-bajo, y  si fuera a la inversa la persona necesita un cambio de dieta inmediatamente.

Mediante un precipitado de proteínas se consigue precipitar las lipoproteínas de baja densidad y las de muy baja densidad (LDL y VLDL ),quedando en el sobrenadante las lipoproteínas de alta densidad.


Valores de referencia:

HDL-colesterol	Hombres	Mujeres
Riesgo menor	>55mg/dl	>65mg/dl
Riesgo normal	35-55mg/dl	45-65mg/dl
Riesgo elevado	<35mg/dl	<45mg/dl

LDL-Colesterol
Valores sospechosos a partir de	150mg/dl
Valores elevados a partir de	190mg/dl

Materiales y Reactivos:

-Muestra (Suero).

-Cubeta.

-Espectrofotómetro.

-Baño María.

-Reactivo A (ácido fosfotungstico 14mM y cloruro de magnesio 2mM).

-Reactivo B (reactivo colesterol).

-Eppendorf.

-Gradilla.



Procedimiento:

-En un tubo de centrifuga añadimos 1ml de muestra y 0.1ml de R.A (precipitante).

-Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente .

-Centrifugar 2 minutos a 12000rpm.

-Llevarlo a una cubeta y medir su absorbancia con el espectrofotómetro.

-En un tubo de ensayo realizamos el blanco en el que pondriamos 1ml de reactivo B.
 

-En otro tubo preparamos la muestra a la que añadimos 0.02ml ded sobrenadante y 1ml de reactivoB.

-Incubar durante 5 minutos a 37ºC.


-Llevar las disoluciones de los tubo a dos cubetas (una para cada tubo).

 -Medimos en el espectrofotómetro a 505nm .



Resultados:

Colesterol: 60.31 mg/dl
Triglicéridos: 76.74mg/dl
HDL:0.256*320=81.92mg/dl

Aplicamos la formula de Friedewal

LDL=Colesterol total -(76.74/5)-81.92

LDL=-36.95mg/dl


Conclusiones:

El resultado es negativo, una de las causas puede ser que no precipitara todas las lipoproteínas de baja y muy baja densidad.

Hemoglobina A1c

Objetivo:

Determinación de la hemoglobina A1c.

Fundamento teórico:

La hemoglobina es una hemoproteína (estructura cuatenaria), de color rojo característico, que transporta dioxígeno desde los organos respiratorios hasta los tejidos.

La prueba de hemoglobina glicosilada A1c  es una examen de sangre para evaluar la diabetes de tipo 2 y preadiabetes, podemos medir el nivel de glucosa de los últimos tres meses. El resultado de la hemoglobina A1c se entrega en porcentaje.

La hemoglobina A1c se eluye de forma específica, previa eliminación por lavado de la hemoglobina (A1a+b)  y se cuantifica por lectura fotométrica a 415nm. La estimación  de la concentración realativa de HbA1c se realiza frente a la concentación de hemoglobina total, determinada también por lectura fotométrica a 415nm.

 Valores de referencia:

(4-6.5)%-------------- No diabético
(6-7)%  -------------- Objetivo
(7-8)%---------------- Buen control
(>8)% ---------------- Precisa actuación


Materiales y Reactivos:

-Reactivo 1 (Ftalato de potasio 50mmol/L, detergente  5g/l, azida de sodio 0.95g/l pH 5).

-Reactivo 2 (Tampón fosfatos 30mmol/L,  pH 6.5, azida de sodio 0.95g/l).

-Reactivo 3 (Tampón fosfatos 72mmol/L, pH 6.5, azida de sodio 0.95g/l).

-Microcolumnas (Contienen resinas de intercambio catiónico equilibrada con tampón fosfatos 72mmol/L, pH 6.5, azida de sodio 0.95 g/l).

-Cubetas.

-Espectrofotómetro.

- Tubo de ensayo.



Procedimiento:

-Atemperar los reactivos y columnas.

-En un tubo de ensayo, añadimos 50 μL de sangre y 200 μL de reactivo 1. Agitar y dejar a temperatura ambiente.

-La columna se debe poner unos minutos en posición invertida para que la resina no este tan apretada (5-10 minutos). Volver a colocar en posición vertical. Destapar la parte superior de la columna y romper la lengueta. Empujamos hasta que toque el filtro la resina. Dejar gotear hasta que el líquido alcance el nivel de líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluido.

-Aplicar sobre el disco el tubo de ensayo que habiamos preparado anteriormente  (hemolizado). Desechar el eluido.

-Añadir 200μL de reactivo 2 , desechamos el eluido.

-Añadir 2ml de reactivo 2, desechar el eluido, (pasan las hemoglobinas que no me interesan).

-Añadir 4ml de reactivo 3, recoger el eluido (cambia el pH y se despeje la hemoglobina que me interesa).

-Para cuantificar la hemoglobina lo lleva al espectrofotómetro con un patrón que tenga todos Hb total.

-Anotar los resultados.


Resultados:

Patrón -0.569

Muestra-0.298



0.298/(3*0.569)*100=17.45% HbA1c 











Conclusiones:

El nivel de hemoglobina A1c ha salido muy alto, fuera de los valores de normalidad , tendriamos que repetir la práctica para confirmar el resultado. Si se confirma el resultado seguramente tenga diabetes tipo2 y hay que tratar al paciente urgentemente.

Triglicéridos.

Objetivo:

Determinación cuantitativa de triglicéridos.

Fundamento teórico:

Los triglicéridos son un tipo de lipído, la función principal de los tiglicéridos es almcanar energía (grasa) lo almacenan las células constituyentes del tejido adiposo,

Desde el punto de vista bioquimico está formado por la unión de tres ácidos grasos a una molécula de glicerina.

Los triglicéridos incubados por lopoproteinlipasa liberan glicerol  y acidos grasos libres. El glicerol es fosforilado por glicerolfosfato  deshidrogenasa  y ATP en presencia del glicerol quinasa para producir glicerol-3-fosfato  y adenosina-5-difosfato y peróxido de hidrógeno  por glicerolfosfato deshidrogenasa.


 El peróxido de hidrogeno recciona con 4-aminofenazona y p-clorofenol, reacciona catalizada por la peroxidasa dando una coloración roja.   La intensidad del color es proporcional a la concentración de triglicéridos.

Valores de referencia:

Hombres  (40-160)mg/dl.
Mujeres   (35-135)mg/dl.


Materiales y Reactivos:
 


-Cubetas.

-Especrtofotómetro.

-R1 (GOOD y p-clorofenol).

-R2 (Lipoproteína lipasa, Glicerol quinasa, Glicerol-3-oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona y ATP).

-Tubos de ensayo.

 -Gradilla.

-Reactivo de trabajo.

-Muestra (suero).

-Patrón.


Procedimiento:

-Preparar   el reactivo de trabajo  (disolver el contenido de un vial de R2).

-Coger tres tubos de ensayos.

-Un tubo de ensayo  para la preparación del blanco, añadiendo 1ml de reactivo de trabajo.

-Otro tubo de ensayo  para el patrón, añadiendo 1ml de reactivo de trabajo y 10μL.

-En el último tubo de ensayo para la muestra, añadiendo 1ml de reactivo de trabajo y 10μL.

-Depositar el contenido de los tubos de ensayo en las cubetas.
 

-Llevar las cubetas al espectrofotómetro, para medir la absorbancia de las tres cubetas.

- Anotar los resultados.


Resultados:

Muestra-0.096

Patrón-0.202

Blanco-0.03


(0.096-0.039/(0.202-0.03)*200=76.74mg/dl


Conclusiones:

El suero de la práctica pertenece a una mujer, está dentro de los valores de referencia por lo que el paciente tiene unos triglicéridos dentro de la  normalidad. 

Colesterol

Objetivo:

Determinación cuantitativa de colesterol.

Fundamento teórico:

El colesterol es un lipído, la mayor parte se produce en el higado se encuentra en el plasma sanguineo y en los tejidos corporales. El cuerpo necesita colesterol para fabricar hormonas, vitamina D y otras sustancias. El aumento del colesterol en la sangre puede ser peligroso y producir ateroesclorosis.

 El colesterol origina un compuesto coloreado, la intensidad del color es proporcional a la cantidad del colesterol presente  en la muestra..

Valores de referencia

Menos de 200mg/dl--- Normal

200-239 mg/dl  ----Moderado

240 o más -------Alto


Materiales y Reactivos:

-Reactivo 1 (PIPES pH 6.9 y Fenol).

-Reactivo 2 (Colesterol esterasa, Colesterol oxidasa, peroxidasa y 4-aminofenazona).

-Tubos de ensayo.

-Gradilla.

-Cubeta.

-Espectrofotómetro.

-Micropipeta.

-Puntas de micropipeta.

-Muestra (suero).


Procedimiento:

-Preparamos el reactivo de trabajo.

-Coger tres tubos de ensayo para preparar el blanco, patrón y la muestra.

-En un tubo preparamos la muestra, que se prepara  con un 1ml de reactivo de trabajo y 10μL de muestra.

-En otro tubo preparamos el patrón 1ml de reactivo de trabajo y 10μL de patrón.

-En el último tubo prepramos el blanco, añadiendo un 1ml de reactivo de tabajo.

-Llevar el contenido de los tubos de ensayo a la cubetas.
 

-Espectrofotómetro a 505nm de longitud de onda, medir la turbidez presente en las cubetas.

-Anotar los resultados.



Resultado:

Muestra: 0.099

Patrón: 0.319

Blanco: 0.004

(0.099-0.004)/(0.319-0.004)*200=60.3mg/dl

Conclusiones:

El valor que nos ha dado  es  60.3mg/dl  menos de 200mg/dl , por lo que podemos concluir que el paciente no sufre riesgo ya que tiene el valor del colesterol dentro de la normalidad.