Identificación y cuantificación de lipoproteínas en suero sanguíneo.

Objetivo:

Identificación y cuantificación de lipoproteínas en suero sanguineo.

Fundamento teórico:

Las lipoproteínas son macromoléculas compuestas por lípidos y proteínas encargadas del transporte.
Su función es envolver los líquidos insolubles en el plasma proveniente de alimentos y los sintetizados por nuestro organismo.

Se clasifican según la migración electroforética, durante el curso de la cual se separan en varias fracciones distintas que de menor a mayor se clasifican en quilimicrones, ß-lipoproteínas (LDL), pre-ß-lipoproteinas (VLDL), α -lipoproteínas (HDL) y pre-α -lipoproteínas.

Quilimicrones,	(4-13)%
ß-lipoproteínas (LDL)	(10-26)%
pre-ß-lipoproteinas (VLDL)	(0-15)%
α -lipoproteínas (HDL)	(55-75)%
Pre-α -lipoproteinas	(0)%

 

Materiales y Reactivos:

-Alimentador para electroforesis

-Cubeta

-Aplicador para la muestra.

-Tiras de Cellogel

-Papel de filtro

-Láminas de Mylar

-Pipeta automática

-Pinzas de disección

-Bandejas

-Placas de vidrio

-Estufa

-Tampón

-Colorante negro Súdan A

-Colorante negro Súdan B (NaOH al 5%)

-Solución transparentadora


Procedimiento:

-Preparación del tampón:

Añadimos 100ml de Tris-Hipuratoconcentrado en 1000mml de agua destilada.

-Preparación de las tiras de Cellogel:

Introducir las tiras en el tampón, agitar durante (10-15) minutos. Conservar las sobrantes en solución metanol al (30-40)%.

-Preparación de la cubeta de electroforesis:

Llenar una cubeta con tampón.

-Muestra:

Utilizar suero fresco y no hemolizado

-Preparación de la bandeja de muestras:

Pipetee 30μL  de cada muestra en al bandeja de muestras.

-Secado de las tiras:

Eliminar el exceso de tampón de las tiras entre dos hojas de papel de filtro.

-Colocación de las tiras en el puente y aplicación del suero:

Las tiras Cellogel se colocan en el puente con la superficie porosa hacia arriba. Coloca el puente en la camara de electroforesis. Con el aplicador (previamente cargado) aplicamos la muestra en la tira durante 10 segundos , cerca del polo negativo y a 1.5cm del borde. Tapamos la cubeta de electroforesis y conectamos la fuente de alimentación.



-Migración:

200V durante 35 minutos.
 

-Tinción:

Mezclar 50ml de Negro Sudán A con 50ml de negro de Sudán B. Sumergir la tira en la disolución de tinción durante dos horas.

-Decoloración:

Extraer la tira del baño y lavar con agua corriente.

-Transparentado:

Sumergir la tiras de Cellogel en la disolución transportadora  durante un minuto. Ponga la tira en una lámina Mylar y seque el exceso de líquido con papel de filtro. Calentar en al estufa a 80ºC durante (4-6) minutoshasta que la tira se vuelva semitransparente. Introducir en agua, la tira transparentará por completo. Cubra con otra lámina Mylar y leer el resultado en el fotodensitómetro a 580nm.













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