Objetivo:
Determinación cuantitativa de urea.
Fundamento teórico:
La cantidad de urea presente en la sangre permite detectar si los riñones tienen problemas para reabsorber la urea, que es un producto de desecho del hígado y del resto del cuerpo.
La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en amoniaco y anhidrido carbónico.
Los iones amonio reaccionan con salicilato e hipoclorito, en presencia del catalizador nitroprusiato, para formar un indofenol verde. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de urea en la muestra ensayada.
Valores de referencia: (15-45)mg/dl.
Materiales y Reactivos:
-Cubeta
-Espectrofotómetro
-Tubos de ensayo
-Gradilla
-Reactivo 1 (Tampón fosfato pH 6.7, EDTA, Salicilato sódico y Nitroprusiato sódico)
-Reactivo 2 (Hipoclorito sódico e hidróxido sódico)
-Reactivo 3 (Ureasa)
-Muestra (suero)
Procedimiento:
-Preparación del reactivo de trabajo: disolver R3 en el vial de R1.
-El R3 con ClONa está listo.
-Cogemos tres tubos de ensayo, uno para el blanco añadimos 1ml de reactivo de trabajo y otro ml de reactivo 2. Otro tubo para el patrón que está compuesto de 1ml de reactivo de trabajo, 1ml de reactivo de trabajo y 10 μL de patrón y por último el tubo de la muestra debe contener 1ml de reactivo de trabajo, 1ml de reactivo 2 y 10μL de muestra.
-Pasar el contenido de los tubos a tres cubetas.
-Medir la absorbancia en un espectrofotómetroa una longitud de onda de 580nm.
Resultados:
Blanco 0.0
Patrón 0.29
Muestra 0.314
(0.314/0.29)*50= 54.13mg/dl
Conclusiones:
El valor está fuera de los valores de normalidad.
Creatinina.
Objetivo:
Determinación cuantitativa de creatinina.
Fundamento teórico:
Se estudia la creatinina para ver si el riñon funciona correctamente. Se puede medir por medio de la sangre o de la orina.
El ensayo de la creatinina esta basado en la reacción de la creatinina con el picrato de sodio descrito por Jaffé. La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo rojizo. El intervalo de tiempo escogido para las lecturas permite eliminar gran parte de las interferencias conocidas del método. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de creatinina de la muestra.
Valores de referencia
Materiales y Reactivos:
-Cubeta.
-Espectrofotómetro.
-Reactivo 1 (ácidopicrico)
-Muestra (suero).
-Reactivo 2 (Hidróxido sódico).
-Patrón.
-Tubo de ensayo
-Gradilla
Procedimiento:
-Preparación del reactivo de trabajo: mezclar volumenes iguales de reactivo 1 y reactivo 2.
-Coger tres tubos de ensayo, en uno de ellos preparamos el blanco en el cual añadimos 1ml de reactivo de trabajo. En otro tubo, añadimos preparamos el patrón añadiendo 1ml de reactivo de trabajo y 100μL de patrón, en el último tubo añadimos 1ml de reactivo de trabajo y 100μL.
-El contenido de los tubos lo ponemos en las cubetas.
-Mezclar y poner en marcha el cronómetro.
-Leer la absorbancia al cabo de treinta segundos y al cabo de noventa segundos de la adición de la muestra.
Resultados:
Δpatrón=0.327-0.304=0.023
Δmuestra=0.349-0.345=4*10-3
(4*10-3)/(0.023)*2=0.3478 mg/dl
Conclusiones:
El valor que no ha dado esta práctica no se encuentra dentro de los valores de normalidad. Los reactivos estaban caducados y a mis compañeros le salian datos similares.
Determinación cuantitativa de creatinina.
Fundamento teórico:
Se estudia la creatinina para ver si el riñon funciona correctamente. Se puede medir por medio de la sangre o de la orina.
El ensayo de la creatinina esta basado en la reacción de la creatinina con el picrato de sodio descrito por Jaffé. La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo rojizo. El intervalo de tiempo escogido para las lecturas permite eliminar gran parte de las interferencias conocidas del método. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de creatinina de la muestra.
Valores de referencia
Hombres
|
(0.7-1.4)mg/dl
|
Mujeres
|
(0.6-1.1)mg/dl
|
Materiales y Reactivos:
-Cubeta.
-Espectrofotómetro.
-Reactivo 1 (ácidopicrico)
-Muestra (suero).
-Reactivo 2 (Hidróxido sódico).
-Patrón.
-Tubo de ensayo
-Gradilla
Procedimiento:
-Preparación del reactivo de trabajo: mezclar volumenes iguales de reactivo 1 y reactivo 2.
-Coger tres tubos de ensayo, en uno de ellos preparamos el blanco en el cual añadimos 1ml de reactivo de trabajo. En otro tubo, añadimos preparamos el patrón añadiendo 1ml de reactivo de trabajo y 100μL de patrón, en el último tubo añadimos 1ml de reactivo de trabajo y 100μL.
-El contenido de los tubos lo ponemos en las cubetas.
-Mezclar y poner en marcha el cronómetro.
-Leer la absorbancia al cabo de treinta segundos y al cabo de noventa segundos de la adición de la muestra.
Resultados:
Creatinina
|
30``
|
60``
|
Blanco
|
0.001
|
0.00
|
Patrón
|
0.304
|
0.327
|
Muestra
|
0.314
|
0.349
|
Δpatrón=0.327-0.304=0.023
Δmuestra=0.349-0.345=4*10-3
(4*10-3)/(0.023)*2=0.3478 mg/dl
Conclusiones:
El valor que no ha dado esta práctica no se encuentra dentro de los valores de normalidad. Los reactivos estaban caducados y a mis compañeros le salian datos similares.
Identificación y cuantificación de lipoproteínas en suero sanguíneo.
Objetivo:
Identificación y cuantificación de lipoproteínas en suero sanguineo.
Fundamento teórico:
Las lipoproteínas son macromoléculas compuestas por lípidos y proteínas encargadas del transporte.
Su función es envolver los líquidos insolubles en el plasma proveniente de alimentos y los sintetizados por nuestro organismo.
Se clasifican según la migración electroforética, durante el curso de la cual se separan en varias fracciones distintas que de menor a mayor se clasifican en quilimicrones, ß-lipoproteínas (LDL), pre-ß-lipoproteinas (VLDL), α -lipoproteínas (HDL) y pre-α -lipoproteínas.
Materiales y Reactivos:
-Alimentador para electroforesis
-Cubeta
-Aplicador para la muestra.
-Tiras de Cellogel
-Papel de filtro
-Láminas de Mylar
-Pipeta automática
-Pinzas de disección
-Bandejas
-Placas de vidrio
-Estufa
-Tampón
-Colorante negro Súdan A
-Colorante negro Súdan B (NaOH al 5%)
-Solución transparentadora
Procedimiento:
-Preparación del tampón:
Añadimos 100ml de Tris-Hipuratoconcentrado en 1000mml de agua destilada.
-Preparación de las tiras de Cellogel:
Introducir las tiras en el tampón, agitar durante (10-15) minutos. Conservar las sobrantes en solución metanol al (30-40)%.
-Preparación de la cubeta de electroforesis:
Llenar una cubeta con tampón.
-Muestra:
Utilizar suero fresco y no hemolizado
-Preparación de la bandeja de muestras:
Pipetee 30μL de cada muestra en al bandeja de muestras.
-Secado de las tiras:
Eliminar el exceso de tampón de las tiras entre dos hojas de papel de filtro.
-Colocación de las tiras en el puente y aplicación del suero:
Las tiras Cellogel se colocan en el puente con la superficie porosa hacia arriba. Coloca el puente en la camara de electroforesis. Con el aplicador (previamente cargado) aplicamos la muestra en la tira durante 10 segundos , cerca del polo negativo y a 1.5cm del borde. Tapamos la cubeta de electroforesis y conectamos la fuente de alimentación.
-Migración:
200V durante 35 minutos.
-Tinción:
Mezclar 50ml de Negro Sudán A con 50ml de negro de Sudán B. Sumergir la tira en la disolución de tinción durante dos horas.
-Decoloración:
Extraer la tira del baño y lavar con agua corriente.
-Transparentado:
Sumergir la tiras de Cellogel en la disolución transportadora durante un minuto. Ponga la tira en una lámina Mylar y seque el exceso de líquido con papel de filtro. Calentar en al estufa a 80ºC durante (4-6) minutoshasta que la tira se vuelva semitransparente. Introducir en agua, la tira transparentará por completo. Cubra con otra lámina Mylar y leer el resultado en el fotodensitómetro a 580nm.
-
Identificación y cuantificación de lipoproteínas en suero sanguineo.
Fundamento teórico:
Las lipoproteínas son macromoléculas compuestas por lípidos y proteínas encargadas del transporte.
Su función es envolver los líquidos insolubles en el plasma proveniente de alimentos y los sintetizados por nuestro organismo.
Se clasifican según la migración electroforética, durante el curso de la cual se separan en varias fracciones distintas que de menor a mayor se clasifican en quilimicrones, ß-lipoproteínas (LDL), pre-ß-lipoproteinas (VLDL), α -lipoproteínas (HDL) y pre-α -lipoproteínas.
Quilimicrones,
|
(4-13)%
|
ß-lipoproteínas (LDL)
|
(10-26)%
|
pre-ß-lipoproteinas (VLDL)
|
(0-15)%
|
α -lipoproteínas (HDL)
|
(55-75)%
|
Pre-α -lipoproteinas
|
(0)%
|
Materiales y Reactivos:
-Alimentador para electroforesis
-Cubeta
-Aplicador para la muestra.
-Tiras de Cellogel
-Papel de filtro
-Láminas de Mylar
-Pipeta automática
-Pinzas de disección
-Bandejas
-Placas de vidrio
-Estufa
-Tampón
-Colorante negro Súdan A
-Colorante negro Súdan B (NaOH al 5%)
-Solución transparentadora
Procedimiento:
-Preparación del tampón:
Añadimos 100ml de Tris-Hipuratoconcentrado en 1000mml de agua destilada.
-Preparación de las tiras de Cellogel:
Introducir las tiras en el tampón, agitar durante (10-15) minutos. Conservar las sobrantes en solución metanol al (30-40)%.
-Preparación de la cubeta de electroforesis:
Llenar una cubeta con tampón.
-Muestra:
Utilizar suero fresco y no hemolizado
-Preparación de la bandeja de muestras:
Pipetee 30μL de cada muestra en al bandeja de muestras.
-Secado de las tiras:
Eliminar el exceso de tampón de las tiras entre dos hojas de papel de filtro.
-Colocación de las tiras en el puente y aplicación del suero:
Las tiras Cellogel se colocan en el puente con la superficie porosa hacia arriba. Coloca el puente en la camara de electroforesis. Con el aplicador (previamente cargado) aplicamos la muestra en la tira durante 10 segundos , cerca del polo negativo y a 1.5cm del borde. Tapamos la cubeta de electroforesis y conectamos la fuente de alimentación.
-Migración:
200V durante 35 minutos.
-Tinción:
Mezclar 50ml de Negro Sudán A con 50ml de negro de Sudán B. Sumergir la tira en la disolución de tinción durante dos horas.
-Decoloración:
Extraer la tira del baño y lavar con agua corriente.
-Transparentado:
Sumergir la tiras de Cellogel en la disolución transportadora durante un minuto. Ponga la tira en una lámina Mylar y seque el exceso de líquido con papel de filtro. Calentar en al estufa a 80ºC durante (4-6) minutoshasta que la tira se vuelva semitransparente. Introducir en agua, la tira transparentará por completo. Cubra con otra lámina Mylar y leer el resultado en el fotodensitómetro a 580nm.
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Determinación del HDL-colesterol por espectrofotometría.
Objetivo:
Determinación del HDL.
Fundamento teórico:
El colesterol pertenece al grupo de lípidos que es útil para las fibras nerviosas, paredes celulares y equilibrio de ciertas hormonas.
El colesterol HDL (colesterol bueno) son lipoproteínas de alta densidad que realizan la función de eliminar el exceso del colesterol (colesterol malo).
Los niveles de colesterol deben ser HDL-alto y LDL-bajo, y si fuera a la inversa la persona necesita un cambio de dieta inmediatamente.
Mediante un precipitado de proteínas se consigue precipitar las lipoproteínas de baja densidad y las de muy baja densidad (LDL y VLDL ),quedando en el sobrenadante las lipoproteínas de alta densidad.
Valores de referencia:
Materiales y Reactivos:
-Muestra (Suero).
-Cubeta.
-Espectrofotómetro.
-Baño María.
-Reactivo A (ácido fosfotungstico 14mM y cloruro de magnesio 2mM).
-Reactivo B (reactivo colesterol).
-Eppendorf.
-Gradilla.
Procedimiento:
-En un tubo de centrifuga añadimos 1ml de muestra y 0.1ml de R.A (precipitante).
-Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente .
-Centrifugar 2 minutos a 12000rpm.
-Llevarlo a una cubeta y medir su absorbancia con el espectrofotómetro.
-En un tubo de ensayo realizamos el blanco en el que pondriamos 1ml de reactivo B.
-En otro tubo preparamos la muestra a la que añadimos 0.02ml ded sobrenadante y 1ml de reactivoB.
-Incubar durante 5 minutos a 37ºC.
-Llevar las disoluciones de los tubo a dos cubetas (una para cada tubo).
-Medimos en el espectrofotómetro a 505nm .
Resultados:
Colesterol: 60.31 mg/dl
Triglicéridos: 76.74mg/dl
HDL:0.256*320=81.92mg/dl
Aplicamos la formula de Friedewal
LDL=Colesterol total -(76.74/5)-81.92
LDL=-36.95mg/dl
Conclusiones:
El resultado es negativo, una de las causas puede ser que no precipitara todas las lipoproteínas de baja y muy baja densidad.
Determinación del HDL.
Fundamento teórico:
El colesterol pertenece al grupo de lípidos que es útil para las fibras nerviosas, paredes celulares y equilibrio de ciertas hormonas.
El colesterol HDL (colesterol bueno) son lipoproteínas de alta densidad que realizan la función de eliminar el exceso del colesterol (colesterol malo).
Los niveles de colesterol deben ser HDL-alto y LDL-bajo, y si fuera a la inversa la persona necesita un cambio de dieta inmediatamente.
Mediante un precipitado de proteínas se consigue precipitar las lipoproteínas de baja densidad y las de muy baja densidad (LDL y VLDL ),quedando en el sobrenadante las lipoproteínas de alta densidad.
Valores de referencia:
HDL-colesterol
|
Hombres
|
Mujeres
|
Riesgo menor
|
>55mg/dl
|
>65mg/dl
|
Riesgo normal
|
35-55mg/dl
|
45-65mg/dl
|
Riesgo elevado
|
<35mg/dl
|
<45mg/dl
|
LDL-Colesterol
|
|
Valores sospechosos a partir de
|
150mg/dl
|
Valores elevados a partir de
|
190mg/dl
|
Materiales y Reactivos:
-Muestra (Suero).
-Cubeta.
-Espectrofotómetro.
-Baño María.
-Reactivo A (ácido fosfotungstico 14mM y cloruro de magnesio 2mM).
-Reactivo B (reactivo colesterol).
-Eppendorf.
-Gradilla.
Procedimiento:
-En un tubo de centrifuga añadimos 1ml de muestra y 0.1ml de R.A (precipitante).
-Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente .
-Centrifugar 2 minutos a 12000rpm.
-Llevarlo a una cubeta y medir su absorbancia con el espectrofotómetro.
-En un tubo de ensayo realizamos el blanco en el que pondriamos 1ml de reactivo B.
-En otro tubo preparamos la muestra a la que añadimos 0.02ml ded sobrenadante y 1ml de reactivoB.
-Incubar durante 5 minutos a 37ºC.
-Llevar las disoluciones de los tubo a dos cubetas (una para cada tubo).
-Medimos en el espectrofotómetro a 505nm .
Resultados:
Colesterol: 60.31 mg/dl
Triglicéridos: 76.74mg/dl
HDL:0.256*320=81.92mg/dl
Aplicamos la formula de Friedewal
LDL=Colesterol total -(76.74/5)-81.92
LDL=-36.95mg/dl
Conclusiones:
El resultado es negativo, una de las causas puede ser que no precipitara todas las lipoproteínas de baja y muy baja densidad.
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